Fluorescencja białka GFP od dziesięcioleci ułatwia biologom obserwowanie procesów zachodzących w żywych komórkach. GFP (ang. Green Fluorescent Protein) pochodzi z meduzy Aequorea victoria i emituje intensywne zielone światło po wzbudzeniu światłem o długości fali w zakresie niebieskim lub ultrafioletowym, co umożliwia śledzenie białek i genów pod mikroskopem fluorescencyjnym.
Jak działa GFP i skąd bierze się jego fluorescencja
GFP to białko zbudowane z 238 aminokwasów tworzących charakterystyczną strukturę wewnętrzną przypominającą beczułkę (beta-barrel). W jego wnętrzu, po prawidłowym sfałdowaniu łańcucha białkowego, powstaje tzw. chromofor – fragment cząsteczki odpowiedzialny za emisję światła zielonego. Proces formowania chromoforu wymaga serii reakcji chemicznych zachodzących wewnątrz białka i trwa — tylko po jego utworzeniu GFP zaczyna fluorescencję.
Dzięki tym właściwościom badacze mogą łączyć gen kodujący GFP z innymi genami, co prowadzi do powstania białek fuzyjnych, które świecą, gdy są obecne w komórce. Ta cecha umożliwia obserwację lokalizacji, dynamiki i ekspresji docelowych białek w czasie rzeczywistym bez konieczności utrwalania materiału.
Nowe spojrzenie na ograniczenia GFP w badaniach
W typowych eksperymentach przyjmuje się, że obecność fluorescencji odpowiada obecności badanego białka i że brak sygnału oznacza jego brak. Najnowsze badania polskiego zespołu, opublikowane w International Journal of Biological Macromolecules, wskazują jednak, że te założenia mogą prowadzić do błędnej interpretacji wyników.
Okazuje się bowiem, że samo GFP może nie zawsze prawidłowo się fałdować i formować aktywny chromofor. W chwili gdy białko dopiero się zwija po raz pierwszy, jego cząsteczki są bardziej podatne na tworzenie nieprawidłowych form, które agregują i nie emitują światła. W takiej postaci GFP staje się niewidoczne pod mikroskopem, mimo że docelowe białko jest obecne. To samo może dotyczyć cząsteczek, które już raz zostały sfałdowane – różne stany przejściowe prowadzą do opóźnionego pojawienia się fluorescencji.
Skutki agregacji i stresu komórkowego
Kolejnym problemem, na który zwracają uwagę naukowcy, jest to, że cząsteczki GFP, które nie składają się prawidłowo, mogą łączyć się w agregaty. Takie agregaty, o ile nie świecą, mogą być błędnie interpretowane jako brak markera, i – co ważniejsze – mogą wywoływać odpowiedź stresową w komórce. Mechanizmy komórkowe mogą uznać nieprawidłowe białka za zagrożenie i aktywować systemy naprawcze lub ich degradację. W efekcie obserwowany proces może odzwierciedlać odpowiedź na dysfunkcję znacznika, a nie naturalne zachowanie badanego białka.
Znaczenie wyników dla przyszłych badań
Konsekwencje tych ustaleń są istotne nie tylko dla biologów komórki w laboratoriach, ale także dla badań biomedycznych, w których GFP jest szeroko stosowany – na przykład przy analizie białek związanych z chorobą Alzheimera, nowotworami, czy sygnałami wewnątrzkomórkowymi. Niewłaściwa interpretacja sygnału fluorescencji albo jego braku może prowadzić do mylnych wniosków o dynamice i obecności konkretnych struktur biologicznych.
Dodatkowo, problem ten nie ogranicza się wyłącznie do klasycznego GFP. Istnieje cała gama białek fluorescencyjnych o różnych kolorach i właściwościach, które mają podobne mechanizmy fałdowania i mogą wykazywać analogiczne ograniczenia.
Wnioski dla praktyki badawczej
Uświadomienie sobie tych ograniczeń zachęca do krytycznej oceny wyników opartych na sygnale fluorescencyjnym. Naukowcy coraz częściej muszą łączyć mikroskopię fluorescencyjną z innymi metodami biochemicznymi i molekularnymi, by mieć pewność, że obserwowany sygnał rzeczywiście odzwierciedla naturalne procesy komórkowe.
